背景简介
质粒是可独立于染色体自行复制的环状DNA，常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型，少部分为RNA型。
由于其人工性质，实验室质粒通常被称为载体（vector）或构建体（constructs）。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。
质粒载体的命名规则
所有载体名称都以字母“p”开头，代表质粒“plasmid”，“p”字母后面是载体骨架的缩写，2-4个大写字母代表发明者、实验室名称或者其他表型性状。
常见质粒载体名称：
LV: Lentivirus，慢病毒载体
MMLV: MMLV retrovirus，MMLV逆转录病毒载体
AV: Adenovirus，腺病毒载体
AAV: Adeno-associated virus，腺相关病毒载体
慢病毒质粒载体
在众多工具载体中，慢病毒，由于其可以将外源片段随机插入细胞基因组，可在细胞内长期表达目的基因，且免疫原性低、安全性高，是重要的基因操作工具。获得慢病毒颗粒首先需要进行慢病毒载体质粒构建。
慢病毒载体质粒有很多种，常用的包括pLVX、pCDH、pLenti等，不同的实验室或者研究者可能会选择不同的载体。吉满生物挑选了四种常见的慢病毒载体质粒，对其适用的实验和研究进行了一句话概括，让您可以快速选择合适您实验的载体质粒~
pLKO.1
最常用的慢病毒载体质粒之一，其中包含人类U6启动子和H1启动子，以及EGFP或RFP等标记物。它是一种经典的RNAi工具，可以用于基因敲除和RNAi研究。
pLenti-CMV-GFP
一种基于CMV启动子的慢病毒载体质粒，可以用于高效表达融合蛋白和其他目的蛋白。它带有EGFP标签，可以用于快速筛选成功转染的细胞。
pLVX-Puro
一种基于CMV启动子的慢病毒载体质粒，可以用于高效表达目的蛋白和RNAi工具。它带有Puro标记，可以用于快速筛选转染的细胞，并通过药物选择增加稳定表达的细胞数量。
pCDH
这一系列载体是一种基于第三代慢病毒系统的载体，采用双启动子设计，可同时控制外源基因和荧光蛋白表达，提高表达效率和稳定性。同时有多种药物筛选标记和荧光标记选择。
载体选择要素
质粒图谱
载体选择需要结合其质粒图谱信息，质粒图谱是质粒DNA序列的物理图谱，包括质粒的大小、筛选标记、多克隆位点、转录及翻译元件等信息，为我们选择质粒、了解质粒特点及应用提供了重要依据。
质粒图谱包含的四大要素：
复制起点(ori)：控制质粒复制的起始点，决定了质粒的宿主和拷贝数。
筛选标记：多为抗生素抗性基因，用于检测和筛选含有质粒的细胞。
多克隆位点区(MCS)：外源基因的插入位点。
其他元件：如启动子、增强子/沉默子、核糖体结合位点、转录终止信号等，这些元件对于质粒的表达和调控至关重要。
载体元件：
在进行基因调控的载体构建时，主要考虑到的载体元件有以下几个：
1、启动子
启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子主要分为广谱启动子和特异性启动子。
广谱启动子为在各种组织、细胞上广泛表达的启动子。
常用广谱启动子有CAG，CMV，EF1a，PGK等，属于Ⅱ型启动子，用于启动常规基因的表达，其转录产物长度不限，编码与否不限。还包含启动RNA的Ⅲ型启动子，如U6和H1启动子，主要表达非编码短序列RNA，如sgRNA、shRNA，连续4个或5个t为终止信号。
特异性启动子为在特异性组织或者细胞类型上表达的启动子。
常用特异性启动子如成熟神经元特异性启动子hSyn，投射神经元特异性启动子CaMKIIa，星型胶质细胞特异性启动子GfaABC1D，心肌特异性启动子cTNT，肝实质细胞特异性启动子TBG等。
2、荧光标记
常用的荧光标记有eGFP（绿色荧光蛋白）、ZsGreen1（绿色荧光蛋白）、mCherry（红色荧光蛋白）、mScarlet（红色荧光蛋白）。通过荧光蛋白的表达可以用于标记细胞或标记蛋白。
针对编码蛋白，常规推荐目的基因和荧光蛋白非融合表达，通过荧光观察感染效率。若需要用荧光标记目的基因的位置，如亚细胞定位等实验时可考虑做目的基因和荧光蛋白融合表达。因蛋白均有自己的空间结构，若选择融合表达，两个蛋白可能会相互影响。
3、抗性标记
抗性基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否，如果抗性基因成功导入并表达基因，那么该生物就具有相应的抗性，据此判断基因表达载体是否成功导入细胞内。
常用原核抗性：Amp（氨苄青霉素抗性基因），Kan（卡那霉素抗性基因）。在质粒转化感受态细胞进行摇菌抽提时，需要原核抗性进行目的质粒的感受态细胞筛选。
常用真核抗性：Puro（嘌呤霉素抗性基因），blasticidin（杀稻瘟菌素抗性基因），Neo（新霉素抗性基因），Zeo（博来霉素抗性基因），Hygro（潮霉素抗性基因）
其中Puro和blasticidin是较常用的真核抗性，真核抗性常用于稳定株筛选等过程，具体使用抗性筛选的浓度可通过空细胞抗性预实验确认，浓度梯度可根据抗生素说明书推荐浓度范围设置。
4、蛋白标签（protein tag）
定义：与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。
常见标签：3xFLAG，6xHis，HA，Myc，GST等。需注意目的蛋白是否有功能肽，如信号肽，前肽等，避免融合后对功能肽的表达产生影响。
5、其他
当细胞中需要表达一个以上的基因时，可以使用连接元件，实现在单个载体上同时表达多个基因的目的，且连接元件前后的序列为同一启动子表达，同时连接元件代替独立启动子有助于减小质粒长度。
常用的两种连接元件如下：
自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)
平均长度为18-22个氨基酸，2A上下游的基因同时转录，同时翻译，翻译后的肽段在2A的最后一个脯氨酸断开，最终分别得到一个融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白。
优点：2A肽结构短小并且上下游基因的表达平衡性好；
缺点：不同基因不同细胞中2A断裂效率有所不同。
内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)
IRES元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能进而可以启动下游基因的翻译。处在IRES元件上下游的两个基因同时转录，独立翻译，最终得到两个独立的蛋白。
优点：独立翻译，进而可以表达得到完整的目的蛋白；
缺点：IRES的结构较大，其应用常受到载体容量的限制，并且IRES对下游基因翻译起始能力相对较弱，因此经常为保证目的基因的表达，将荧光蛋白放在IRES下游，可能会导致荧光偏弱。
根据自己的实验需求，选择合适的启动子、荧光标记，抗性标记等，进行慢病毒质粒载体的构建，再使用合适的慢病毒包装体系进行慢病毒包装，得到所需的慢病毒颗粒应用于细胞感染及稳转细胞系的构建。
慢病毒包装
所谓慢病毒包装，即将生产病毒所需的组件拆分为多个质粒（第2代系统为3个，第3代系统为4个），质粒共转到包装用的细胞（HEK293T）中，进而产生慢病毒颗粒。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染HEK293T细胞，在细胞中表达质粒和包装质粒分别表达出病毒的遗传信息和蛋白，进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，通过超速离心的方式进行慢病毒浓缩，得到高滴度的慢病毒浓缩液。
目前常用的慢病毒包装系统主要分两类：
第二代慢病毒三质粒系统
表达质粒：pLVX-Puro、pLVX-IRES-Puro、pLVshRNA-EGFP(2A)Puro
包装质粒：pSPAX2、pMD2.G
第三代慢病毒四质粒系统
表达质粒：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro
包装质粒：pLP1、pLP2、pLP-VSVG
病毒包装服务
吉满生物致力于病毒包装，可提供一系列慢病毒现货产品（包括过表达、永生化、iPS、自噬、CRE、亚细胞定位等）以及慢病毒包装服务。
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