背景简介
1963年，Christian de Duve首次提出了自噬（Autophagy）的概念，该词源自希腊语：“auto”表示自我，“phagy”表示进食，合起来就是“自己吃自己”的意思。
自噬是真核细胞通过形成双层膜的自噬体包裹并降解自身细胞质成分（如蛋白质、细胞器）的过程，是一种细胞自我保护机制。
在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。
完整的自噬发生过程包括自噬启动、自噬体形成、自噬溶酶体形成，降解及再利用。自噬过程是由大量蛋白质和蛋白质复合物所控制的，每种蛋白质负责调控自噬体启动与形成的不同阶段，具有重要的生理功能，并和肿瘤，神经退行性疾病等密切相关。
自噬相关蛋白
在自噬的发生过程中，有多种自噬相关蛋白可调节和控制自噬形成的不同阶段。
迄今为止，科学家已在酵母中鉴定出40余个编码ATG蛋白的基因，并且大多数在酵母和哺乳动物之间高度保守。在哺乳动物细胞中，饥饿诱导的自噬大约受20种核心ATG基因调节，它们在液泡附近被不断募集，并组装形成自噬前体。
常见的自噬检测方法
01 透射电镜法
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
自噬经历了三个阶段：吞噬泡(phagophore)-自噬小体(autophagosome)-自噬溶酶体(autolysosome)。
图片来源网络
02 LC3荧光标记检测法
LC3全称MAP1LC3，它贯穿整个自噬过程。
哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。自噬发生时，LC3 蛋白合成后立即在其羧基端被 Atg4 所剪切，产生细胞浆定位的 LC3-I。
在自噬过程中，LC3-I 会被包括 Atg7 和 Atg3 在内的泛素样体系所修饰和加工，产生分子量为14kD的 LC3-II，并定位到自噬小体中。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被ATG4切割，产生LC3-I循环利用。LC3-II 的含量和发生自噬的程度成正比，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
得益于荧光蛋白技术的发展，我们可以通过荧光蛋白标记的方式，直观的看到自噬现象和过程。
LC3双荧光标记法
图示：构建mRFP-GFP-LC3双荧光标记系统，使用红色荧光蛋白mRFP来标记及追踪LC3，用绿色荧光蛋白GFP指示自噬溶酶体。因为GFP对酸性环境敏感，自噬溶酶体呈酸性，一旦自噬溶酶体形成，GFP就会发生淬灭，此时只能观察到红色荧光。因此，GFP的减弱表明溶酶体与自噬小体融合形成了自噬溶酶体。而mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。
吉满自主研发的双荧光自噬标记自噬产品，可用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化 →自噬研究工具 | LC3自噬慢病毒实验原理及应用
LC3单荧光标记法
图示：利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，构建绿色荧光蛋白GFP-LC3融合蛋白，当细胞内没有自噬发生时，GFP-LC3融合蛋白会均匀地分散在细胞质中，一旦细胞内出现自噬活动，GFP-LC3融合蛋白就会聚集并转位到自噬体膜，此时在荧光显微镜下可清晰地观察到明亮的绿色斑点。斑点数量的多少就代表了自噬活动的强弱。
吉满自主研发出单荧光标记的自噬指示产品，可以通过计数评价自噬活性的高低！
03 WB检测
1、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。
2、利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以评价自噬水平。在自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解，所以p62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。
自噬检测方法对比
自噬研究具有广泛的生物学和医学意义，有助于揭示细胞的基本生理过程，理解疾病机制，发展新的治疗策略，以及促进人类健康和长寿。
吉满生物可提供一系列细胞自噬研究工具和服务，包括自噬细胞株构建、自噬基因过表达及干扰、自噬诱导剂/抑制剂、自噬信号通路研究等！
欢迎访问吉满生物官网：www.genomeditech.com
免费咨询电话：400-627-9288
