背景介绍
慢病毒
慢病毒（Lentivirus,LV）是逆转录病毒科下的一个属，其基因结构和其他逆转录病毒类似。包含RNA和蛋白，遗传信息储存在RNA中，衣壳糖蛋白与细胞膜上特异受体结合而进入易感靶细胞。其RNA进入靶细胞，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。是目前细胞及模式生物实验中非常有效的基因研究工具。
慢病毒载体
慢病毒载体则是以慢病毒基因组为基础，对慢病毒自身的元件，如LTR，Gag，Pol，Env等进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。目前以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础改造而来的慢病毒载体最为常用，它可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，实现目的基因的长期、稳定表达。 慢病毒包装 慢病毒包装，则是将生产病毒所需的组件拆分为多个质粒（第2代系统为3个，第3代系统为4个），质粒共转到包装用的细胞（HEK293T）中，进而产生慢病毒颗粒。 吉满生物拥有14年+的慢病毒包装服务经验，秉承“服务至上，品质为先”的理念，已为近25000名科研用户提供专业的技术支持和售后解答。 本篇列举了慢病毒包装实验过程中的9个常见问题，供各位老师学习参考！ 慢病毒包装实验Q&A 如何确定某株细胞的MOI值？ MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量越多，也代表了病毒对细胞的感染能力，MOI越高，细胞越难被感染。 MOI值高低多受细胞本身影响，不同实验室细胞状态等差异可能导致细胞MOI值有区别，建议实验前都先用带有GFP的对照病毒进行MOI预实验摸索合适MOI值，进而确定病毒用量，通过文献或参考数据设置预实验感染梯度，如MOI较高可选择高滴度病毒或促感染试剂进行优化。 可通过如下公式进行计算MOI或病毒用量： MOI=病毒滴度×感染的病毒量/细胞个数 如何提高慢病毒对细胞的感染效率？ 慢病毒对细胞的感染效率受多种因素影响，如细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被慢病毒感染的难易程度（MOI）等，因此保证细胞正常增殖，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。 对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率，如将细胞培养板密封后，用平角转子离心机1000g离心1h，再放回培养箱中正常培养。 慢病毒感染细胞后什么时候基因表达到达峰值？ 慢病毒表达时间较慢，一般代谢旺盛的细胞（如293T、BHK21等）48h后可以观察到GFP荧光（或者RFP红色荧光）； 代谢比较缓慢的细胞（如原代培养细胞、神经干细胞、胚胎干细胞等）GFP（RFP）蛋白表达所需时间较长，感染后72-96h甚至更长时间可以观察到GFP（RFP）荧光。 过表达慢病毒因载体中插入目的基因序列，可能荧光相比对照病毒稍弱；如载体中带有cas9/dcas9等较大蛋白，建议感染后7~10天再继续下游实验。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行换液或传代，以保证良好的生长状态。 细胞能被慢病毒感染，但为何荧光很弱？ 慢病毒感染细胞后，由于目的基因与荧光蛋白表达的方式不一样，导致荧光表达有差异的情况也时有发生。细胞中荧光强度受病毒载体及细胞等因素影响。 融合荧光：目的基因与荧光蛋白融合表达，少数的目的基因对融合的荧光蛋白的荧光有影响。可能是目的基因表达量低，导致融合蛋白的表达量也低，进而荧光不亮；也可能是目的基因对荧光蛋白的结构和功能有影响，导致荧光不亮。 IRES连接：使用目的基因-IRES-荧光蛋白的结构，由于IRES下游基因表达偏弱，容易导致荧光弱。 2A连接：使用目的基因-2A-荧光蛋白结构，2A上游的目的基因和下游荧光蛋白在蛋白翻译时断开，如果上游目的基因表达量低，也会导致下游荧光蛋白表达受影响，导致荧光弱，此外，2A元件连接断开不完全，可能存在融合表达同样存在影响。 启动子影响：目的基因和荧光蛋白使用不同的启动子表达，荧光蛋白接在强启动子后面时荧光表达强，接在弱启动子后面时荧光表达较弱，同时，不同类型的启动子在不同细胞中启动效果也会有影响，某些细胞可能需要特殊的启动子启动荧光或者目的基因表达。 细胞增殖及观察时间：通常目的细胞感染的慢病毒颗粒数越多，细胞本身增殖越快，荧光会越强；慢病毒在增殖较快的细胞中感染96~120h后，荧光蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中感染后，荧光蛋白表达达到峰值需要更长的时间。 为什么过表达慢病毒没有对照病毒的荧光强？ 和病毒的容量有关，插入较长基因后，荧光强度会随着插入基因的长度或特殊结构（高GC）的存在而减弱，尤其是高GC片段，由于影响了转录，荧光强度会降低；另外，对照病毒的滴度相对较高，同等体积的病毒，对照的病毒量大。 曝光时间很长才能观察到荧光？ 排除荧光显微镜问题：看对照病毒，如对照病毒也不亮属于显微镜问题； PH值：若PH值较低，会导致绿色荧光猝灭，可根据培养基颜色判断（是否发黄）； 目的基因的慢病毒可能会比对照病毒的光弱一些，属于正常现象，可延长曝光时间。 慢病毒通常可以装多大的基因？ 通常情况下，需要构建的基因长度（含有标记基因在内）不超过4kb。 因为慢病毒表达载体包含了5’LTR、3’LTR、WPRE等相关元件，一般情况下整个LTR长度与滴度相关，载体越大，病毒滴度越低，可通过载体情况及构建序列长度对病毒滴度进行预估。 慢病毒载体不包病毒能不能当质粒用？ 不包病毒的慢病毒质粒可用于瞬转，类似于普通载体质粒，但装载序列的慢病毒载体整体较大，通常情况下，载体越大，瞬转效率越低。 有现成的慢病毒质粒能不能直接用于吉满的病毒包装？ 对于客户提供的慢病毒载体质粒，由于载体系统的来源及结构的不同，包装病毒时在兼容性、产量、滴度等方面都可能存在有差异。 吉满使用二三代兼容的包装系统，会先对提供的质粒进行售前评估，如包装风险较大，建议换我们常用载体对包装滴度更有保障，低风险质粒可进行少量包装确定滴度再进行大量扩增。 慢病毒包装服务 吉满生物可提供一系列慢病毒现货产品（过表达、永生化、iPS、自噬、CRE、亚细胞定位等）及定制服务。 吉满生物在包装过程中，采用专业的工艺和标准化的流程，确保产品的纯度和活性，助力科研工作顺利推进。从质粒构建到病毒包装仅需5周即可发货！ 更多产品与服务欢迎访问吉满生物官网：www.genomeditech.com
